細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。

細(xì)胞培養(yǎng)是在人工環(huán)境下，將細(xì)胞種植或培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，提供適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和條件，使細(xì)胞能夠在體外持續(xù)生長和繁殖的過程。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗中，有一些細(xì)節(jié)，對于高效地完成實(shí)驗十分重要。本期內(nèi)

容，盤點(diǎn)細(xì)胞實(shí)驗“實(shí)戰(zhàn)"過程中的關(guān)鍵點(diǎn)。

實(shí)驗前準(zhǔn)備

1、明確細(xì)胞身份

在實(shí)驗正式開始前，需要根據(jù)實(shí)驗?zāi)康模_定所需的細(xì)胞系。不同的細(xì)胞系在形態(tài)、生理、代謝和功能等方面有很大的差異。選擇適合研究目的的細(xì)胞系可以增加實(shí)驗的準(zhǔn)確性和可靠性。

選擇來源靠譜的細(xì)胞系（細(xì)胞類型、細(xì)胞來源、細(xì)胞代數(shù)等信息），根據(jù)不同細(xì)胞來源，尋找相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)資料，明確培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)物添加量、培養(yǎng)條件（溫度、濕度、二氧化碳濃度）等。

2、實(shí)驗室環(huán)境清潔

在細(xì)胞實(shí)驗開始前，需要對細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行清潔消毒甚至是滅菌處理。儀器、培養(yǎng)室墻壁與地面、培養(yǎng)室空間都應(yīng)采取對應(yīng)的清潔措施。

3、準(zhǔn)備實(shí)驗材料

選擇高品質(zhì)的實(shí)驗耗材與試劑，盡可能選擇無菌化處理過后的，若非無菌級，則需自行滅菌后才可用于細(xì)胞培養(yǎng)。

胎牛血清是許多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗中一種重要的添加物。提供對維持細(xì)胞指數(shù)生長的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。還能夠提供結(jié)合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)節(jié)它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。

Ausbian進(jìn)口特級胎牛血清，精選內(nèi)毒素更低批次（≤3EU/ml），澳洲血源，是細(xì)胞典藏等重大項目十幾年的穩(wěn)定供應(yīng)品牌。新批次在試用前，提供試用服務(wù)，養(yǎng)細(xì)胞更放心。全程冷鏈運(yùn)輸，減少反復(fù)凍融對胎牛血清品質(zhì)的影響。

實(shí)驗過程

細(xì)胞復(fù)蘇

——液氮中取出的細(xì)胞，待液氮揮發(fā)后，馬上將細(xì)胞凍存管置于37℃水浴中輕輕搖動使快速融化（盡量控制在2min內(nèi)，時間過長了可能會影響細(xì)胞的狀態(tài)）。在解凍時，凍存管瓶口盡量控制在水面以上。

——解凍后，將凍存管轉(zhuǎn)移到無菌操作臺，75%酒精擦拭凍存管外部。

——將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至，裝有37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，棄上清。

——重新加入經(jīng)預(yù)熱培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以適宜密度，一般約為(3~5)×10^5個/ml密度接種到培養(yǎng)器皿（直徑10cm）中。放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況。

細(xì)胞傳代

——用移液器吸取并丟棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導(dǎo)致易污染），并用PBS緩慢沖洗細(xì)胞2次。

——以直徑10cm的培養(yǎng)皿為例，向培養(yǎng)皿中加入500μl胰蛋白酶-EDTA（根據(jù)各細(xì)胞的使用說明，選擇合適的濃度）消化液，輕輕搖動培養(yǎng)皿，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，放到37 ℃ 孵育（一般2分鐘左右即可）。鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，傾斜培養(yǎng)瓶時細(xì)胞層能自然流即可終止，此時應(yīng)加入2-3ml含血清的培養(yǎng)液終止消化（細(xì)胞的解離時間標(biāo)準(zhǔn)可能偏差，根據(jù)細(xì)胞來源確定，有些細(xì)胞屬于半貼壁，無需胰蛋白酶也可解離）。

——吸取所有培養(yǎng)皿內(nèi)的液體，沿培養(yǎng)皿底部緩慢吹打，重復(fù)該動作2-3次，使所有細(xì)胞沿瓶底流下，再輕柔地把細(xì)胞吹打成單個懸液（吹打過程中應(yīng)盡量避免氣泡的產(chǎn)生）。

——把所有的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后棄上清。

——加入培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液。按實(shí)驗所需的細(xì)胞量添加到新的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿37 ℃ 孵育，每天觀察細(xì)胞的貼壁情況。

注意：向培養(yǎng)皿加液體時，建議從與貼壁細(xì)胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動細(xì)胞層，前后搖晃容器數(shù)次，最后移棄沖洗液。若是懸浮細(xì)胞傳代培養(yǎng)，過程中省消化步驟。

細(xì)胞凍存

——按照“細(xì)胞傳代"中的步驟收集細(xì)胞。

——加入細(xì)胞凍存液（一般10%DMSO+對應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基），重懸細(xì)胞，使細(xì)胞的終密度為(5~10)×10^5個/ml，移入細(xì)胞凍存管中。

——程序降溫，更推薦使用程序降溫盒。若手動進(jìn)行降溫，凍存的一般程序為降溫速度1～2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，可將降溫速度增加至5℃～10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。

污染控制

1、設(shè)備的清潔與滅菌

在開始任何細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗之前，必須對所有設(shè)備、耗材和試劑進(jìn)行滅菌處理，當(dāng)然，我們推薦實(shí)驗人員盡量選擇商品化的無菌試劑。

滅菌方法包括高壓滅菌、過濾、紫外線照射、乙醇噴灑或擦拭、消毒清潔試劑噴灑或擦拭等。

2、環(huán)境的清潔與滅菌

所有細(xì)胞培養(yǎng)工作應(yīng)在無菌和清潔的環(huán)境中進(jìn)行。因此要對實(shí)驗環(huán)境進(jìn)行清潔與滅菌。

包括實(shí)驗前對實(shí)驗空間定期清潔，包括桌面、地面、墻面、生物安全柜操作臺等，開始實(shí)驗前，還應(yīng)打開生物安全柜中的紫外線燈進(jìn)行照射滅菌。

除了常規(guī)的消毒試劑，這里推薦使用德國Minerva Biolabs的Mycoplasma-off支原體祛除噴霧劑，不僅對支原體起作用，還能高效清除并預(yù)防細(xì)菌、真菌等污染物。水浴鍋、培養(yǎng)箱水槽等環(huán)境，可以添加Water Shield™，有效預(yù)防水源中的支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子的污染。

3、正確處理實(shí)驗材料

正確處理實(shí)驗材料，實(shí)驗操作應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定、避免交叉污染。包括佩戴適當(dāng)?shù)膫€人防護(hù)設(shè)備，如手套、口罩；及時更換移液器一次性器具等操作。

4、實(shí)驗室合理布局

在實(shí)驗過程中，嚴(yán)格遵守實(shí)驗室中物品擺放準(zhǔn)則，以培養(yǎng)箱舉例：培養(yǎng)皿擺放密度應(yīng)合理，宜少不宜多等。

5、定期監(jiān)測培養(yǎng)物

定期監(jiān)測培養(yǎng)物，對于及早發(fā)現(xiàn)和解決而言，也是一個關(guān)鍵點(diǎn)。這包括在顯微鏡下檢查培養(yǎng)物狀態(tài)、肉眼觀察培養(yǎng)基的形態(tài)、顏色等變化等。必要時可以使用PCR技術(shù)定期測試微生物污染的存在。