牛血清是重要的細(xì)胞培養(yǎng)添加成分，具有終止胰蛋白酶消化，提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用。

根據(jù)采血時(shí)間的不同，牛血清通常分為：

• 胎牛血清（采自5-8月胎齡）

• 新生牛血清（采自出生0-7天內(nèi)，也有說(shuō)法是0-30天內(nèi)）

• 小牛血清（采自出生30天-1年）

• 成牛血清（采自成牛）

理論上，優(yōu)質(zhì)的胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)方面通常優(yōu)于其他類型的血清， 與新生牛和小牛血清相比，各類生長(zhǎng)因子含量更為豐富，且由于5-8月胎牛沒(méi)有形成完整的補(bǔ)體系統(tǒng)，因此在使用的時(shí)候無(wú)需熱滅活。

但是由于胎牛血清價(jià)格相對(duì)而言會(huì)更高一些，不同實(shí)驗(yàn)對(duì)于血清的需求也不同，因此，如何挑選適合自己實(shí)驗(yàn)的血清就顯得尤為重要。總的原則就是，綜合考慮各實(shí)驗(yàn)室、生產(chǎn)企業(yè)的條件與所培養(yǎng)細(xì)胞類型。除了以往根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道，必要時(shí)也可進(jìn)行針對(duì)特定細(xì)胞的血清篩選試驗(yàn)，以篩選出最佳血清。

今天我們來(lái)分享一篇國(guó)內(nèi)研究人員發(fā)表在《生物學(xué)雜志》上的標(biāo)題為《不同類型牛血清對(duì)MDCK細(xì)胞培養(yǎng)效果研究》的文獻(xiàn)，該研究對(duì)進(jìn)口胎牛血清、國(guó)產(chǎn)胎牛血清、國(guó)產(chǎn)新生牛血清在MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的促生長(zhǎng)效果進(jìn)行了闡述。

研究方法

作者在含10%不同類型牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中連續(xù)傳代培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞，比較了三種血清培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性、最大増殖密度、倍增時(shí)間、比生長(zhǎng)速率、貼壁率等指標(biāo)。

1、貼壁培養(yǎng)傳代穩(wěn)定性觀察

分別用含有10%A、B、C血清的DMEM培養(yǎng)基復(fù)蘇MDCK工作庫(kù)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至致密單層時(shí)，分別用含有3種類型血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并連續(xù)傳代10代，傳代時(shí)細(xì)胞均按照1∶6比例，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。每代細(xì)胞在24和48 h拍照觀察細(xì)胞形態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)及致密程度。

2、生長(zhǎng)曲線及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析

取第4代3種類型血清培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好且鋪滿單層的MDCK細(xì)胞，計(jì)數(shù)稀釋至1×10^4 個(gè)/mL，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接1 mL細(xì)胞懸液。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h消化3孔計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。按照此方法，對(duì)培養(yǎng)至第6代、第9代的MDCK細(xì)胞重復(fù)該試驗(yàn)2次，計(jì)算3次平均值,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。并比較3種類型血清培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的最大増殖密度、倍增時(shí)間、比生長(zhǎng)速率和平均比生長(zhǎng)速率。

3、貼壁率分析

取第4代、第6代和第9代3種類型血清培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好且鋪滿單層的MDCK細(xì)胞，按1.2.1所述方法將細(xì)胞稀釋至1×10^3個(gè)/mL，制成50 cells/4 mL的細(xì)胞懸液，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入4 mL的細(xì)胞懸液，并做平行3孔。將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，出現(xiàn)集落后，用吸管吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗，無(wú)水甲醇固定，結(jié)晶紫染色。觀察并對(duì)細(xì)胞集落計(jì)數(shù),計(jì)算平均值。

4、細(xì)胞工廠擴(kuò)大培養(yǎng)驗(yàn)證

取第10代C血清培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好且鋪滿單層的MDCK細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，擴(kuò)大培養(yǎng)至1層細(xì)胞工廠連續(xù)傳3代，加150 mL細(xì)胞培養(yǎng)液,接種密度為(8～9)×10^4 個(gè)/mL，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，用上述方法，接種10層細(xì)胞工廠，加1.5 L細(xì)胞培養(yǎng)液,接種密度為(8～9)×10^4個(gè)/mL，每12 h用細(xì)胞工廠觀察臺(tái)觀察,待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，繼續(xù)傳代培養(yǎng)3代，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并在長(zhǎng)成致密單層時(shí)消化計(jì)數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

• 在最大增殖密度和倍增時(shí)間上，胎牛血清均優(yōu)于新生牛血清。

• 在貼壁率方面［貼壁率(% ) = (所形成集落數(shù)/ 接種細(xì)胞數(shù)) ×100%］，進(jìn)口胎牛血清略高于國(guó)產(chǎn)胎牛血清，差異顯著；國(guó)產(chǎn)新生牛血清低于國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口胎牛血清，差異極顯著。

總結(jié)

對(duì)于生產(chǎn)或研究所用的培養(yǎng)細(xì)胞，大多數(shù)情況下，生產(chǎn)或研究人員可以依據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)以及文獻(xiàn)報(bào)道選擇合適的血清。在個(gè)別不確定的情況下，也可參考以上文章的方法進(jìn)行最適血清的篩選。

參考文獻(xiàn)：

[1]李自良,王家敏,趙彩紅,王美皓,李倬,喬自林,馬忠仁.不同類型牛血清對(duì)MDCK細(xì)胞培養(yǎng)效果研究[J].生物學(xué)雜志,2020,37(04):21-25.

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