當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，將會出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞的生長和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。此時(shí)如果不及時(shí)進(jìn)行分裝再培養(yǎng)，即傳代培養(yǎng)，細(xì)胞將逐漸走向衰老、死亡。將培養(yǎng)的細(xì)胞從一個(gè)容器以1∶2或其他比率轉(zhuǎn)移到其他容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。貼附型生長細(xì)胞采用酶消化傳代法，而懸浮型生長細(xì)胞則采用直接傳代法或離心傳代法，以下將分別加以介紹。

實(shí)驗(yàn)操作

以貼壁細(xì)胞培養(yǎng)為例

1、穿好細(xì)胞房專用的實(shí)驗(yàn)服，戴好滅菌手套和口罩。

2、從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿（Tip1：一般選擇處于對數(shù)期的細(xì)胞），用75%酒精消毒外包裝后轉(zhuǎn)移至到超凈臺中。

3、打開蓋子（Tip2：如果是培養(yǎng)皿，只需打開一個(gè)縫隙即可，避免污染），輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，加入適量PBS緩沖液洗滌1-2次（Tip3：注意從未培養(yǎng)細(xì)胞的側(cè)壁加入，以免沖掉細(xì)胞），棄去PBS緩沖液。

4、用移液器加入適量胰酶（Tip4：具體量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定，提前將胰酶37℃預(yù)熱，效果更好），蓋好蓋子，“十字"晃動，使胰酶充分接觸細(xì)胞。

5、將加入胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡載物臺，鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞變圓且大量脫落時(shí)，準(zhǔn)備終止消化（Tip5：若初始的細(xì)胞密度比較高，加入胰酶后，肉眼也可觀察到細(xì)胞脫落，當(dāng)細(xì)胞有一半左右脫落時(shí)，即可終止消化，避免反復(fù)將培養(yǎng)皿拿出超凈臺，避免增加污染的風(fēng)險(xiǎn)），用75%的酒精噴灑培養(yǎng)瓶表面，轉(zhuǎn)移到超凈臺。

6、用移液器加入等量含血清培養(yǎng)基，終止消化。移液器充分且柔和地吹打，避免產(chǎn)生氣泡，使細(xì)胞*脫落。

7、將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中混合液體轉(zhuǎn)移至離心管中（離心管規(guī)格根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定），配平后離心3-5分鐘左右（離心機(jī)轉(zhuǎn)速根據(jù)細(xì)胞種類而定，常見的有1000-3000rpm/min）。

8、離心好后，用酒精噴壺噴灑離心管表面，轉(zhuǎn)移進(jìn)超凈臺，打開蓋子，將上清液倒入廢液缸。

9、加入適量體積含血清培養(yǎng)基，用移液器或巴氏吸管輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液。

10、將細(xì)胞懸液分裝進(jìn)2個(gè)（或多個(gè)）潔凈滅菌培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，加入適量培養(yǎng)基，蓋好蓋子。

11、將分裝好的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡載物臺，觀察細(xì)胞情況，細(xì)胞應(yīng)保證一定數(shù)量，數(shù)量太少會影響生長情況。

12、在培養(yǎng)瓶上做標(biāo)記，注明傳代時(shí)間，細(xì)胞種類，操作人員等信息。在放入培養(yǎng)箱之前應(yīng)再次用酒精噴一噴培養(yǎng)瓶表面，然后應(yīng)記得整理操作臺，用75%酒精擦拭超凈臺臺面，清理廢液和垃圾。

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