細(xì)胞生長(zhǎng)受溫度、滲透壓等外界因素的影響。

溫度

一般哺乳類及禽類細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜溫度是37~38℃。溫度過高或過低都會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞耐受低溫的能力比抗熱的能力強(qiáng)，在低溫下，細(xì)胞的代謝活力及核分裂降低。溫度不低于0℃時(shí)，雖影響細(xì)胞代謝，但并無傷害作用；把細(xì)胞置于25～35℃時(shí)，細(xì)胞仍能生存和生長(zhǎng)，但速度減緩；放在40℃數(shù)小時(shí)后，再置回37℃培養(yǎng)細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)。但如果在40℃下暴露時(shí)間太長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利，甚至變圓脫落于瓶壁。若溫度過低，在降到冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞因胞外水和胞質(zhì)結(jié)冰而受損死亡。但若向培養(yǎng)液中加入甘油或二甲亞砜等保護(hù)劑，封入安瓿中后，置于液氮中，可起保護(hù)作用，此時(shí)細(xì)胞可耐受-70℃以下溫度，能長(zhǎng)期儲(chǔ)存，解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)生長(zhǎng)增殖，細(xì)胞生物性狀不受任何影響。此為保存細(xì)胞的主要手段。

。細(xì)胞在39～40℃培養(yǎng)1小時(shí)，能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)，但不能忍受溫度再升高2℃，持續(xù)數(shù)小時(shí)，即在41～42℃中培養(yǎng)1小時(shí)，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，溫度至43℃以上時(shí)細(xì)胞多數(shù)被殺死。高溫主要引起酶的滅活、類脂質(zhì)破壞，核分裂的破壞，產(chǎn)生凝固酶使細(xì)胞發(fā)生凝固，另外使蛋白質(zhì)變性。因此，體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)一定要避免高溫。

滲透壓

細(xì)胞在高滲溶液或低滲溶液中，可以立即發(fā)生皺縮或腫脹、破裂。所以，滲透壓是體外培養(yǎng)細(xì)胞的重要條件之一。哺乳動(dòng)物和其他動(dòng)物組織細(xì)胞體外培養(yǎng)的滲透壓的維持主要與NaCl有關(guān)，但不能忽視其他電介質(zhì)滲透壓的關(guān)系。滲透壓與單位體積溶媒內(nèi)溶質(zhì)的分子數(shù)和離子數(shù)成正比。為此，按一定比例控制培養(yǎng)液中離子平衡，維持正常滲透壓是很重要的。這不僅是為了維持細(xì)胞張力，而且是為了調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝。因?yàn)榧?xì)胞外離子輸送和離子濃度改變著其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送(如氨基酸、蔗糖等)，直接影響細(xì)胞基本合成系統(tǒng)。

理想的滲透壓因細(xì)胞的類型及種族而異，人血漿滲透壓為290mmol/L，被視為是體外培養(yǎng)人類細(xì)胞的理想滲透壓。哺乳類動(dòng)物細(xì)胞的滲透壓一般為290～300mmol/L。人胚肺成纖維細(xì)胞為250～325mmol/L，鼠則為310mmol/L左右。在實(shí)際應(yīng)用中，260～320mmol/L的滲透壓可適于大多數(shù)細(xì)胞。

氣體環(huán)境和pH

體外培養(yǎng)細(xì)胞需要理想的氣體環(huán)境，氧和二氧化碳是細(xì)胞生存必須的條件之一。氧參加細(xì)胞的三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量以供給細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和合成各種所需成分。有些細(xì)胞在低氧條件下，可借糖酵解取得能量，但多數(shù)細(xì)胞低氧時(shí)不能生存。氧張力通常維持在略低于大氣狀態(tài)，若氧分壓超過大氣中氧的含量可能對(duì)有些細(xì)胞有害。采用開放式培養(yǎng)時(shí)(碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng))，一般要把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳的混合氣體環(huán)境中。

CO2既是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，又是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的成分，并與維持培養(yǎng)液的pH有關(guān)。在密閉瓶中CO2濃度偏低的情況下，細(xì)胞容易生長(zhǎng)；一般不能低于1%，否則有損細(xì)胞。CO2增加將使pH下降。大多數(shù)細(xì)胞適于在pH7.2~ pH 7.4條件下生長(zhǎng)，低于pH6.8或高于pH7.6對(duì)細(xì)胞有害，甚至退變或死亡。各種細(xì)胞對(duì)pH的要求不盡相同。一般原代培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)pH的變動(dòng)耐受性差，永生性細(xì)胞系和惡性細(xì)胞對(duì)pH的變動(dòng)耐力強(qiáng)。但總的來說，細(xì)胞對(duì)堿性不如對(duì)酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利。細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中隨細(xì)胞數(shù)量的增多和代謝活動(dòng)的加強(qiáng)，不斷釋放CO2，使培養(yǎng)基變酸，pH發(fā)生變化。所以，為了維持培養(yǎng)環(huán)境恒定的pH，多采用在培養(yǎng)液中加入磷酸鹽等緩沖劑的方法。磷酸緩沖劑中的NaHCO3可供給CO2，但CO2易于逸出，故只適用于封閉式培養(yǎng)。若開放式培養(yǎng)還是置于含有5%CO2的氣體環(huán)境中為宜。為克服NaHCO3調(diào)整的麻煩，也可用羥yi基pai嗪乙硫磺酸(N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-ethanesulfonic acid, Hepes)，它對(duì)細(xì)胞無毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止pH迅速變動(dòng)，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的pH。

無毒和無菌

無毒和無菌是體外培養(yǎng)細(xì)胞的首要環(huán)境條件。細(xì)胞在活體內(nèi)，偶爾有細(xì)菌或有害物質(zhì)入侵，因體內(nèi)有*的解毒系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，可將其解毒或清除，而不易受損害。但在離體的環(huán)境中，失去了防御系統(tǒng)，一旦有害物質(zhì)入侵或細(xì)菌污染，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，前功盡棄。如培養(yǎng)瓶皿、支持物、培養(yǎng)基、瓶蓋、瓶塞上若有細(xì)胞毒性，在培養(yǎng)過程中可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，在選用這些器皿、材料時(shí)要注意，若這些物品消毒不*，帶菌或操作過程不小心使細(xì)胞污染，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。若出現(xiàn)交叉污染，可使實(shí)驗(yàn)室原來的細(xì)胞系失去原有特性，應(yīng)引起足夠的重視(后面有詳述)。

輻射線和超聲波

(一)可見光

可見光的波長(zhǎng)是3900~7800Å。可見光的各種有色光能引起細(xì)胞退變，延長(zhǎng)核分裂的間期，還可顯著降低細(xì)胞的附壁能力。因此，體外培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)避免日光直接照射，最好在黑暗中進(jìn)行培養(yǎng)或短期存放。

(二)紫外線

弱紫外線下耐受能力強(qiáng)的細(xì)胞變化不大，但對(duì)敏感的細(xì)胞有損害。紫外線強(qiáng)時(shí)，新分離的細(xì)胞顯示：不能進(jìn)行*的有絲分裂；在有絲分裂時(shí)增加了脫水收縮；在有絲分裂時(shí)細(xì)胞質(zhì)的起泡減少。Elrlich腹水癌細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后，用飛點(diǎn)紫外線顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)被照射表面形成水泡，隨后細(xì)胞膨脹，損害也漸變嚴(yán)重。

(三)放射線

X射線對(duì)細(xì)胞有明顯損傷。β射線可影響細(xì)胞核的分裂。γ射線使核分裂數(shù)減少并出現(xiàn)不正常的核分裂，可使細(xì)胞死亡。

(四)超聲波和振動(dòng)

在超聲波振動(dòng)下，細(xì)胞很快會(huì)破裂，開始是胞質(zhì)發(fā)生紊亂的流動(dòng)，原生質(zhì)膠體結(jié)核也有明顯變化，若停止超聲波振動(dòng)可回復(fù)。細(xì)胞致死的原因是由于產(chǎn)生空化作用所致。當(dāng)超聲波在2.5W/cm2時(shí)，細(xì)胞受損，染色體發(fā)生畸變，首先發(fā)生畸變的是核染色體。

細(xì)胞接種濃度(密度)

在體外培養(yǎng)細(xì)胞中，細(xì)胞接種數(shù)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有影響，適宜的接種密度，可以促使細(xì)胞增殖，接種密度太低或太高都不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。如果培養(yǎng)液與細(xì)胞的容積比例大于2000:1，生長(zhǎng)物質(zhì)彌散到細(xì)胞外的比例將是細(xì)胞內(nèi)達(dá)到低于最小限度的濃度，此時(shí)細(xì)胞不能再增殖，培養(yǎng)液中的pH變堿，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞變圓不能貼壁，甚至引起細(xì)胞死亡等。如果接種密度太高，每個(gè)細(xì)胞周圍培養(yǎng)液的容積降至0.007mm3以下，由于彌散率的降低，細(xì)胞內(nèi)生物質(zhì)的濃度增加，容易使排除物或其他代謝產(chǎn)物達(dá)到飽和，能量來源也很快耗盡，因此也會(huì)妨礙細(xì)胞的增殖。

如何選擇適宜的接種濃度要根據(jù)細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)繁殖速度以及工作的需要而確定。一般來說，細(xì)胞代謝旺盛、生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞，接種濃度宜偏低；而正常組織細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，代謝不夠旺盛，接種濃度可偏高；如果是為了保種或不需急用，接種濃度可偏低些；有時(shí)為了便于觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，接種濃度也可適當(dāng)降低。

科研實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞的體外培養(yǎng)一直是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞要養(yǎng)好，就要用好血清，如Ausbian®特級(jí)胎牛血清，它適合各種細(xì)胞培養(yǎng)，尤其適合難養(yǎng)細(xì)胞，如：干細(xì)胞、肝細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染細(xì)胞等。

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