PCR方法已廣泛用于科研，在工業(yè)中也有不斷擴大應(yīng)用的趨勢，它包括檢測一些病原體、檢測支原體污染、檢測細(xì)菌污染以及檢測殘留宿主DNA等。

PCR在工業(yè)中的應(yīng)用主要存在一個方法驗證的問題，尤其是靈敏度的驗證。靈敏度不夠，就會發(fā)生漏檢。另外，PCR所直接面對的樣本是DNA，而非病原菌或DNA，因此還需要做DNA抽提，這也是要注意的。

下面以支原體PCR檢測為例，略說說靈敏度的驗證。

藥典規(guī)定，生物藥廠的主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫、生產(chǎn)終末細(xì)胞、檢定細(xì)胞、病毒種子批和病毒收獲液、細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料如培養(yǎng)基、胰酶、臨床治療用干細(xì)胞和免疫細(xì)胞等，都必須不含支原體。

因此，如能采用PCR檢測支原體并替代藥典方法，還是能節(jié)省很多時間和精力。但PCR方法的驗證需要較為全面。靈敏度驗證是一個重要方面。靈敏度不夠，就會發(fā)生漏檢。《歐洲藥典》第2.6.7章（EP 2.6.7）和《日本藥典》第17版第G3章（JP G3），都規(guī)定，對于核酸擴增法（如PCR）檢測支原體，如替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，都要求檢測限達(dá)到10 CFU/ml。

具體驗證可使用10CFU的支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品，它一般為凍干粉形式，需要用待測樣本的樣本基質(zhì)（需保證里面不含支原體）來復(fù)溶，再進(jìn)行DNA抽提以及PCR檢測。如檢測的電泳有條帶，或者qPCR檢測后的Ct值小于40，即表明檢測成功。

因此，在選用支原體PCR法檢測來替代藥典方法時，需要考慮如下兩個方面：

第yi步是要使用符合歐洲藥典要求，經(jīng)過全面驗證的支原體檢測試劑盒，第二部是自我驗證，即確認(rèn)所用的樣本基質(zhì)對于該試劑盒方法是合適的，并且操作過程是正確的。小規(guī)模的室內(nèi)驗證通常需要采用三個不同批次的試劑盒，然后加入10CFU的標(biāo)準(zhǔn)品，做復(fù)孔（通常是8個復(fù)孔），并且至少選擇3個支原體物種進(jìn)行驗證。

有的支原體標(biāo)準(zhǔn)品廠家會提供CFU與基因拷貝數(shù)的比值，以方便二者的換算。因為10CFU只能確定PCR能夠達(dá)到的檢測限在10CFU以下，但無法具體確定靈敏度的數(shù)值。帶DNA拷貝數(shù)標(biāo)定的基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品則可進(jìn)一步確定檢測限的數(shù)值。

總之，PCR方法很有用，但需要避免假陰性，驗證時應(yīng)使用陽性對照、陰性對照、無模板對照和內(nèi)控對照，以保證PCR反應(yīng)正常，以及支原體少量存在時確實能檢出來，支原體不存在時也確保是結(jié)果陰性，從而使得PCR方法在工業(yè)應(yīng)用時能確保終結(jié)果的可靠。

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